481. СРЕДА для DEHALOGENOMONAS (DehM)

Базальный солевой раствор (см. ниже) 10 мл.

Ресазурин 0,001 г

Раствор источника углерода (см. ниже) 5 мл

L-цистеина гидрохлорид 0,25 г

NaHCO₃ 2.52 г

NaOH 0.065 г

Раствор микроэлементов SL-10 (см. ниже) 1мл

Витаминный раствор (см. выше) 1 мл.

Селенит-вольфраматный раствор (см. ниже) 1 мл

Раствор цитрата титана (см. ниже) 4 мл.

1,2-дихлорэтан 0,5 мМ

Смешать раствор базальных солей, раствор источника углерода и раствор резазурина, прокипятить и продуть среду 100% N₂ в течение 30–45 мин, чтобы сделать ее бескислородной. После охлаждения добавьте гидрохлорид L-цистеина и раствор NaOH. Разлить среду в той же газовой атмосфере в бескислородные пробирки типа Хангейта или флаконы с сывороткой и автоклавировать при 121°C в течение 15 мин. Добавить другие компоненты из стерильных бескислородных исходных растворов, приготовленных в атмосфере 100% газа N₂. После инокуляции залить 0,5 мМ 1,2-дихлорэтана в газовой фазе.

Базальный солевой раствор:

NaCl 100 г

KH₂PO₄ 20 г

NH₄Cl 25 г

KCl 50 г

MgCl₂ x 6 H₂O 40 г

CaCl₂ x 6 H₂O 10 г

Дистиллированная вода 1000.00 мл

Раствор источника углерода:

Sodium acetate 0.41 г

Sodium pyruvate 0.55 г

Sodium lactate 0.57 г

Дистиллированная вода 100.00 мл

Раствор микроэлементов SL-10:

HCl (25% 7.7 M) 10.0 мл

FeCl₂ x 4 H₂O 1.5 г

ZnCl₂ 70.0 мг

MnCl₂ x 4 H₂O 100.0 мг

H₃BO₃ 6.0 мг

CoCl₂ x 6 H₂O 190.0 мг

CuCl₂ x 2 H₂O 2.0 мг

NiCl₂ x 6 H₂O 24.0 мг

Na₂MoO₄ x 2 H₂O 36.0 мг

Дистиллированная вода 990.0 мл

Смесь микроэлементов автоклавируют в коричневой бутылке, плотно закрытой резиновыми крышками или пробками; оставить свободное пространство примерно 1/3 объема бутылки.
Продуть свободное пространство газовой смесью H₂/CO₂/N₂ (10%/10%/80%).

Селенит-вольфраматный раствор:

NaOH 0.5 г

Na₂SeO₃ x 5 H₂O 3.0 мг

Na₂WO₄ x 2 H₂O 4.0 мг

Дистиллированная вода 1000.0 мл

Селенит-вольфраматный раствор можно автоклавировать в герметично закрытой бутылке.
Продуть свободное пространство газовой смесью H₂/CO₂/N₂ (10%/10%/80%).

Витаминный раствор:

Биотин 2.00 мг

Фолиевая кислота 2.00 мг

Пиридоксин-HCl 10.00 мг

Тиамин-HCl 5.00 мг

Рибофлавин 5.00 мг

Никотиновая кислота 5.00 мг

Са-D-пантотенат 5.00 мг

Витамин В₁₂ 0.10 мг

п-аминобензойная кислота 5.00 мг

(±)-α-липоевая кислота 5.00 мг

Дистиллированная вода 1000,00 мл

Витаминный раствор следует стерилизовать фильтрованием (размер пор 0,2 мкм) и хранить в темноте при температуре 4°С. Продуть свободное пространство газом, простерилизованным фильтром азотом (N₂) или анаэробной газовой смесью (10 % N₂, 10 % CO₂, 80 % N₂).

Раствор цитрата титана:

Хлорид титана (III) 1.5 г

Цитрат натрия·2 H₂O 5.95 г

Дистиллированная вода 100.00 мл

Добавьте 100 мл дистиллированной воды в стакан, вскипятите в микроволновой печи, а затем осторожно перелейте горячую воду в стеклянную бутылку для сыворотки емкостью 250 мл, в которой находится магнитная мешалка с тефлоновым покрытием. Продуйте воду газообразным N₂ при охлаждении на ледяной бане. Добавьте 5,95 г цитрата натрия·2 H₂O, закройте бутыль с сывороткой бутилкаучуковой пробкой и перемешивайте на мешалке до полного растворения цитрата натрия. Медленно добавьте 1,50 г хлорида титана. Центрифугируйте раствор цитрата титана при 8000×g в течение 20 минут. Слейте надосадочную жидкость в чистый химический стакан, затем стерилизуйте надосадочную жидкость фильтрованием и перенесите ее в четыре аликвоты по 25 мл, причем каждую аликвоту помещают в отдельный стерильный стеклянный флакон с сывороткой емкостью 60 мл. Закройте флаконы с сывороткой бутилкаучуковыми пробками и алюминиевыми обжимными крышками.

Изменения внесены: 13.01.2024